高效液相色谱法测定叶下珠中没食子酸的含量

北京中医药大学学报 2000年第6期第23卷 中药化学

作者：张兰珍　王晓强　贾　辉　马继忠

单位：北京中医药大学　北京100029

关键词：叶下珠；没食子酸；HPLC

　　摘要：以高效液相色谱法测定叶下珠中没食子酸的含量。采用YWG-C18（1 0 μm）色谱柱， 甲醇—水—磷酸（4∶96∶0.05）为流动相，测得叶下珠中没食子酸的含量为0.114%，平 均回收率为103.1%。测定方法快速、灵敏，具有实用价值。

　　中图分类号：R284.1

Determination of Gallic Acid in Phyllanthus Urinaria by HPLC

Zhang Lanzhen (张兰珍), Wang Xiaoqiang (王晓强), Jia Hui (贾　辉), et al.

　　(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)

　　A practical sensitive and fast HPLC method for the determination of ga llic acid in Phyllanthus urinaria L. was developed. To perform this method, the YWG-C18 (10 μm) column and a mobile phase composed of methanol, water an d phosp horic acid (MeOH∶H2O∶H3PO4=4∶96∶0.05) were used. The results of the de termination by this method showed that the mean content of the gallic acid in Ph yllanthus urinaria L. was 0.114%, and the average recovery was 103.1%.

　　KEY WORDS: Phyllanthus Urinaria; Gallic Acid; HPLC

　　叶下珠为大戟科叶下珠属植物叶下珠Phyllanthus urinaria L.的干燥全草。具有平肝 清热，利水解毒的功效。现代药理实验证明叶下珠具有抗 乙肝病毒(HBV) 、保肝等作用［1］。 目前从叶下珠中分离得到的化合物有正十八烷、β-谷甾醇、胡萝卜甙、没食子酸、鞣 花酸、短叶苏木酚酸甲酯、山奈素、槲皮素、去氢柯子次酸三甲酯、芸香甙、羽扇豆醇、蔗 糖、鞣云实精、老鹳草素等［2～5］，其中多酚和可水解鞣质为叶下珠主要活性成分 ,没食子酸的含量最高。没食子酸是可水解鞣质的单体，具有抗病毒的作用，叶下珠中没食子酸的含量测定方法目前 还没有报道。我们用HPLC法测定没食子酸的含量，优选出比较好的提取方法和分离条件，方 法简便、快速、准确，具有实用性。

　　1　材料与仪器

　　HPLC仪为美国BECKMAN 332 型液相色谱仪，进样阀100 μL； 色谱柱YWG-C18由北京 分析 仪器技术公司生产。叶下珠药材1999年采自陕西商洛地区, 由陕西中医研究所郭五保研究员 鉴定； 试剂皆为分析纯； 没食子酸标准品购自中国生物制品检定所。

　　2　方法与结果

　　2.1　色谱条件

　　色谱柱YWG-C18(10 μm,4×250 mm),流动相：甲醇—水—磷酸（4∶96∶0.05）；流 速1 mL /min；检测波长280 nm；柱温：室温；在上述色谱条件下叶下珠中没食子酸与其他干扰峰分 离良好 ,柱效以没食子酸的理论塔板计不得低于554，见图1。

图1　叶下珠中没食子酸的HPLC图

　　2.2　标准曲线的制备

　　精称没食子酸标准品2.0 mg，用30%甲醇定容至5 mL容量瓶中，所得标准品溶液浓度为 （0.4 mg/mL）。精密吸取标准溶液50、100、150、200、250 μL用30%甲醇溶液定容至5 m L容量瓶中，分别吸取100 μL进样，测定色谱峰面积。以色谱峰面积A为纵坐标，没食子酸 对照品的 量为横坐标,求得回归方程为Y=388775X+1589.4(γ=0.9997),线性范围0.4～2.0 μg ，可用外标一点法计算含量。

　　2.3　精密度的测定

　　精密吸取对照品溶液（0.4 mg/mL）100 μL，重复进样5次， 测得色谱峰面积A平均值为461 293, RSD=2.78%。

　　2.4　稳定性实验

　　精密吸取对照品溶液100 μL每隔0.5 h进样测定1次，连续实验6 h，RSD=3.0%，没食子酸 在6 h内很稳定。

　　2.5　提取方法的选择

　　精称叶下珠细粉（40目）0.2 g，按文献［7］分别加入30%甲醇25 mL,称重,超声提取 20、30、40 min,冷浸12、24、48 h,补足原重量，过滤，取续滤液，微孔滤膜过滤后，按色 谱条件测定样品含量，实验表明冷浸法较超声波提取法没食子酸的提取率高，24 h可基本稳 定，故样品采用冷浸24 h提取。

　　2.6　回收率实验

　　精密称取叶下珠药材粉末4份各0.1 g，精密加入没食子酸对照品0.33 mg(配制成标准溶液) ，精密 吸取30%甲醇25 mL，称重,冷浸24 h，补足原重量，过滤，取续滤液，微孔滤膜过滤后，按 色谱条件测定，求得4份平均回收率为103.1%，RSD=1.2%。

　　2.7　样品测定结果

　　精称样品4份各0.2 g，按回收率法制备样品，精密吸取样品供试液60 μL，按上述色谱条 件测定，外标一点法计算含量。结果见表1。

　　2.8　重现性实验

　　精称样品5份各0.2 g，按样品测定法制备样品，精密吸取样品供试液60 μL，测定含 量，求得5份的RSD=2.32%。

表1　叶下珠中没食子酸的含量

　　3　讨论

　　没食子酸为可水解鞣质的结构单元，所测含量为样品所含游离没食子酸和水解出的没食 子酸的含量总和,但不包含在放置条件下不易水解的可水解鞣质中的没食子酸。没食子酸的含量随提取条件不同差异较大,超声波提取法时间短,提取的主要为游离没食 子酸，含量较低。加热提取会使叶下珠中所含的大量可水解鞣质水解破坏，所以本实验没有 采用加热提取的方法。

　　张兰珍，女，36岁，医学硕士，副教授

参　考　文　献

　　1，窦志华.叶下珠属植物抗乙肝病毒的国内研究概况.中成药，1998，20（3）：46

　　2，姚庆强，左春旭.叶下珠化学成分的研究.药学学报，1993，28（11）：829

　　3，李瑞声，王三永，张维汉，等.叶下珠化学成分的研究.中草药，1995，26（5）：231

　　4，万振先，周国平，易扬华. 叶下珠化学成分的研究.中草药，1994，25（9）：455

　　5，万振先，喻庆禄，易扬华.叶下珠化学成分的研究Ⅱ.中草药，1997，28（3）：134

　　6，段天璇，王静竹，冯　鹏.山茱萸炮制前后没食子酸溶出及煎出量比较.中国中药杂志，1 999，24（4）：213

(收稿日期：2000-06-29)